Ausgestattet mit einer gründlichen Schulbildung an Lateinschule und Gymnasium, trug sich Winckelmann am 4. April 1738 als Theologiestudent in die Matrikel der Hallenser Universität ein. Doch war die Wahl des Studienfaches und der Universität nicht ganz frei von äußeren Zwängen.

Die Theologische Fakultät, die als einzige von Staat und Kirche gefördert wurde, erließ den aus mittellosen Familien stammenden Studenten die Studiengebühr. Außerdem forderte ein Edikt König Friedrich Wilhelms I. aus dem Jahre 1729 für diejenigen Studenten, die auf eine Anstellung im Staatsdienst hofften, zwei Studienjahre an der Universität Halle, die seinerzeit als die bedeutendste in Preußen galt.

Aus dem Kollegienverzeichnis der Universität Halle wissen wir, welche Vorlesungen Winckelmann belegt hatte. Er besuchte u. a. die theologischen Kollegs von Christian Benedict Michaelis (1680–1764, von Siegmund Jacob Baumgarten (1706–1757) und von Joachim Lange (1670–1744). Mit Interesse hörte er die Vorlesungen des später von Immanuel Kant hochgeschätzten Alexander Gottlieb Baumgarten (1714–1762), der als Begründer der Ästhetik in Deutschland gilt. Winckelmann schätzte die Vorlesungen vor allem wegen dessen hervorragender Literaturkenntnis. Mit Aufmerksamkeit verfolgte Winckelmann auch die Kollegs von Gottfried Sell (1717–1767), der neben Rechtsgeschichte Vorlesungen über Naturwissenschaften und Physik hielt. Angesichts Winckelmanns früh ausgeprägter Vorliebe für die Antike wird er auch die Vorlesung des Philologen und Mediziners Johann Heinrich Schulze (1687–1744) über griechische und römische Altertümer nach antiken Münzen besucht haben. Am 22. Februar 1740 verließ Winckelmann die Universität mit einem mäßigen Abgangszeugnis, das sich im wesentlichen auf seine Teilnahme an den theologischen Lehrveranstaltungen stützte.

Um sich Geld für einen weiteren Universitätsbesuch zu verdienen – häufig hängte man an das zweijährige Hauptstudium noch ein Jahr freies Studium an einer anderen Universität an –, suchte Winckelmann eine Anstellung als Hauslehrer. Im Frühjahr 1740 trat er etwa für ein Jahr in die Dienste des Oberst Georg Arnold von Grollmann (1698–1762) in Osterburg, damals eine kleine ländliche Garnisonsstadt. Winckelmanns Aufgabe war es in erster Linie, den ältesten Sohn der acht Kinder Grollmanns in Geschichte und Philosophie zu unterrichten. Winckelmann widmete sich in jener Zeit insbesondere den modernen Sprachen Englisch, Französisch und etwas Italienisch.
Im Mai 1741 bezog Winckelmann in der Absicht, sich der Medizin, Geometrie und auch den modernen Sprachen zu widmen, die Universität Jena, die in der ersten Hälfte des 18. Jahrhunderts in den Naturwissenschaften und der Medizin führend war. In Jena galt Winckelmanns besonderes Interesse den Medizinvorlesungen von Georg Erhard Hamberger (1697–1755). Seine Begeisterung für die Medizin und die Naturwissenschaften hat Winckelmann nie ganz aufgegeben, sein Interesse an der Mathematik ließ dagegen nach. Nach knapp einem Jahr verließ Winckelmann die Universität, ohne sich in die Matrikel eingetragen und ein Abschlußzeugnis erhalten zu haben.